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细胞转染

       细胞转染(transfection)是指将dna或者rna导入真核细胞中的过程。转染的目的是产生重组蛋白,或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。

       根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短,可以分为瞬转和稳转。
       

瞬转

稳转

导入的dna没有整合到基因组中,而是保留在细胞核上

导入的dna整合到基因组中

导入的遗传物质不传递到子代; 遗传改变只是暂时的

导入的遗传物质能够代代相传;遗传改变是永久的

不需要选择性筛选

需要选择性筛选出稳定转染的细胞

dna载体和rna都可用于瞬时转染

只有dna载体可用于稳定转染;rna本身不能稳定地导入细胞中

导入的遗传物质的高拷贝数导致高水平的蛋白质表达。

单拷贝数或低拷贝数的稳定整合的dna导致较低水平的蛋白质表达。

通常在转染后24-96小时内收获细胞。

需要2-3周的时间筛选出稳定转染的细胞克隆。

通常不适合使用具有诱导型启动子的载体的研究。

适用于使用带有诱导型启动子的载体的研究。

一般常用的方法:脂质体转染法
       1、材料
       293t细胞、myod表达质粒和egfp表达质粒、dmem培养基、链霉素/青霉素(双抗)、fcs(小牛血清)、pbs(磷酸盐缓冲溶液)、胰酶/edta消化液、转染试剂(transfast)
       2、器材
       20ul/200ul/1ml微量移液器和tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和ccd
       3、实验步骤
       细胞传代
       (1)试验准备:200ul/1mltip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。
       (2)弃掉培养皿中的培养基,用1ml的pbs溶液洗涤两次。
       (3)用tip头加入1mltrypsin液,消化1分钟(37。c,5%co2)。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
       (4)加入1ml的含血清培养基终止反应。
       (5)用tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。
       (6)将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。
       (7)用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8x106个细胞加入一个35mm培养皿。
       (8)将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。
       (9)将培养皿转入co2培养箱中培养,第二天转染。

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