免疫荧光
免疫荧光实验流程
一.脱蜡至水
1. 二甲苯ⅰ(8min)
2. 二甲苯ⅱ(8min)
3. 无水乙醇和二甲苯1:1(5min)
4. 无水乙醇(3min)
5. 95%乙醇(3min)
6. 85%乙醇(3min)
7. 75%乙醇(3min)
8. pbs洗3遍
二.抗原修复
edta抗原修复液修复。
抗原修复100℃ 20min ; 自然冷却至室温。
三.pbst洗2遍,pbs洗1遍。每次5min。
四.用30%h2o2和甲醇配制3%的h2o2溶液。每张切片加1滴,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。pbs洗3遍。
五.封闭 3-5%bsa或者1-2�s封闭30min
六.除去封闭液,每张切片加1滴或50μl的第一抗体,室温下孵育60分钟或4℃过夜,建议参见每种抗体的说明书。
抗体稀释液: 1�s溶液(可以加0.01%叠氮钠)
七.洗一抗。pbs洗3遍,每次5min。
八.孵二抗2h(室温)fitc标记山羊抗小鼠二抗1:500,cy3标记的山羊抗兔二抗1:500。
九.洗二抗 pbs洗3遍,每次5min
十.擦干标本边缘水分,加dapi(1ug/ml)5min
十一. 把片子放pbs里,取一张擦干水分,加mouting(sigma m1289),盖上盖玻片,指甲油封片。